HCV 3′ 末端的研究
研究的緣起
在 HCV 基因組研究總體上持續取得進展的同時，3′末端研究卻陷入了停滯。這是因為臨床樣本中病毒RNA的含量很低，必須通過體外逆轉錄及擴增才能進行克隆；而逆轉錄生成第一鏈 cDNA 的過程，須沿模板 大型公仔RNA 的 3′端向 5′端方向進行。這意味著，如果 3′末端的起始序列未知，則無法設計相應引物對其進行逆轉錄和擴增；而不進行逆轉錄和擴增，反過來又無法開展完整測序。在這樣的背景下，已探明的序列在 3′端最遠只到達某種多展場設計聚核苷酸片段，如霍頓團隊發現的 參展poly(A) 片段。霍頓團隊雖然沒有十足的信心“斷舞臺背板言”此 poly(A) 片段代表了病毒基因組的 3′末端序列，但在提及該片段的時候仍然有意無VR虛擬實境意地將其稱為“尾”（tail）。這多少反映出學界傾向于認同病毒基因組 3′末端以多聚核苷酸片段結尾經典大圖這一結論。
盡管如此，還是有兩支團隊敏銳地發現了問題。他們注意到，只有霍頓團隊報告的基因組 3′末端是以 poly(A) 結尾，而其他研究的結果都是以多聚尿苷酸片段 poly(U) 結尾。以此為切入點，日本 NCCRI 的研究者與美國華盛頓大學（圣路易斯）醫學院的賴斯團隊幾乎同時發起獨立研究，采用兩種不同的技術路徑，分別互動裝置探明了 HCV 基因組 3′末端的序列。
日本NCCRI的研究
日本 NCCRI 取得的突破是利用與 HCV 活動佈置基因組 RNA 互補的負鏈 RNA 實現的。
早在 1989 年，霍頓團隊就在其論文中指出，他們通過 cDNA 克隆捕獲的 HCV RNA 是一條能夠直接編碼蛋白的正鏈 RNA。參比與其同科的黃病毒屬，可推想HCV在其復經典大圖制過程中不會采用逆轉錄方式增殖，而是首先需要以此正鏈 RNA 為模板生成與其互補的全長負鏈 RNA，之后再以此負鏈 RNA 為模板實現正鏈的增殖。1991 年，美國 NIH 的研究者通過 RT-PCR 技術首次捕獲了 HCV 的負鏈 RNA，證實了以上猜想 。1992 年，日本大阪大學的研究者進一步利用此方法對不同組織來源的樣本進行了檢測，發現只有肝組織樣本中存在負鏈 RNA，這說明肝臟是 HCV 復制的場所。
然而，通過 RT-PCR 捕捉負開幕活動鏈 RNA 的技術此時并不成熟，特異性很差——即使只加入一種引物（正鏈或負鏈），HCV 的正、負兩鏈都會出現擴增。針對這一困境，NCCRI 于 1993 年提出假說，指出問題的核心在于目標 RNA 模板中混入了宿主細胞的 RNA 片段。這些雜質會在逆轉錄過程中充當非特異性引物，使非目標鏈也得到逆轉錄和擴增。由于實際操作中很難排除這些雜質，研究者決定在逆轉錄之前，先對底物中所有 RNA 的 3′末端進行化學修飾，使其在逆轉錄過程中無法充當引物；而后再加入單一引物進行 RT-PCR 擴增。結果表明，這種方法可以特異性地獲得正鏈或負鏈的 HCV RNA。該研究于 1994 年發表。
突破這一技術瓶頸之后，NCCRI 再接再厲，馬上將其用于探索 HCV 基因組的 3′末端序列。HCV 基因組 3′末端缺失的主要原因在于逆策展轉錄生成 cDNA 的過程存在方向性。HCV 負鏈 RNA 的發現完美解決了這包裝盒一問題：負鏈的堿基序列與正鏈完全互補，通過負鏈序列即可推知構成病毒基因組的正鏈序列；負鏈的末端方向與正鏈正好相反，其 5′末端序列（對應正鏈的 3′末端）在逆轉錄過程中能夠相對完整地得到保留。
1995 年，NCCRI 從日本最常見大圖輸出的 1b 型平面設計入手，以患者肝組織樣本為原料，使用改良的技術對其中的 HCV 負鏈 RNA 進行 RT-PCR 擴增。通過對產物的克隆與測序，他們不僅確認了病毒基因組 3′末端 poly(U) 的存在，還發現了某些克隆在 po展覽策劃ly(U) 下游的其他序列。這種序列最長可達 98 nt。研究者將其命名為 3′末端的 X 尾（the 3′X tail）。這一序列的發現刷新了人們對 HCV 基因組 3′末端的認識。
1996 年，NCCRI 繼續發表文章，一方面論證了 X 尾確實是 HCV 基因組 3′末端最下游的序列，另一方面也揭示出這段高度保守的序列在廣告設計 HCV 不同基全息投影因型中廣泛存在，可能在病毒復制中發揮作用。至此，HCV 全基因組序列都已探明。
查爾斯·賴斯的研究
賴斯道具製作出生于 1952 年，1974 年獲得動物學學士學位。1975 年，他來到美國加州理工學院，在病毒學家詹姆斯 · 施特勞斯（James Strauss）的實驗室學習生物化學。施特奇藝果影像勞斯當時的研究領域主要是 RNA 病毒。在其影響下，賴斯最初的工作是研究披膜病毒科辛德比斯病毒（Sindbis virus）的基因組結構。1981記者會 年獲得生物化學博士學位后，賴斯繼續留在施特勞斯的實驗室從事博士后研究，主要研究當時同屬披膜病毒科的黃熱病毒（yelVR虛擬實境low fever virus）。通過對病毒 RNA 的測序，賴斯揭示了黃熱病疫苗所使用的毒株（17D） 的基因組序列。同時，他還發現黃熱病毒與其早前研究的辛德比斯病毒存在明顯差異。這一發現推動了以黃熱病毒為代表的黃病毒科從披膜病毒科中獨立出來，成為一個新的病毒分支。1986 年，賴斯獲得了華盛頓大學（圣路易斯）醫學院的教職。
1989 年，賴斯利用 17D 株的全長 cDNA 在體外生成了具有感染性的病毒 RNA。他在黃熱病領域取得的這項成就，正是在 HCV 領域遲遲沒有取得進展的研究。在賴斯取得突破之后，其他研究者相繼通過這種制作全長VR虛擬實境 cDNA 克隆的方法成功獲取了FRP黃病毒科黃病毒屬及瘟病毒屬其他病毒的感染性 RNA。在這樣的背景下，作為黃病毒科的第 3 個病毒屬，HCV 的感染性 cDNA 克隆的制備問題變得愈加緊迫。
就在這一時期，賴斯收到了來自美國食品藥品監督管理局（FDA）研究員斯蒂芬 · 芬斯通（Stephen Feinstone）的研究邀請。芬斯通一直致力于病毒性肝炎相關研究，也非常欣賞賴斯“擺弄”RNA 病毒的能力。他希望賴斯利用其在黃熱病毒基因組方面的專長，在黃熱病疫苗毒株的基礎上開發丙肝疫苗。考慮到 HCV 與自FRP己之前研究的病毒淵源頗深，賴斯欣然接受了邀請，開始投入到 HCV 的分子生物學研究中。
作為進入該領域后的第一項工作，賴斯首先嘗試的是復制之前在黃熱病毒研究中取得的成功，為 HCV制備一個“真正的感染性分子克隆”。他認為準確的測序對于 cDNA 克隆轉錄的 RNA 感染性的恢復“至關重要”，而在事關病毒復制的 3′末端問題上仍然存在的 poly(A) 與 poly(U) 分歧是非常令人“震驚”的 。開幕活動為此大圖輸出，賴斯團隊展開了關于病毒基因組 3′末端序列的研究。
事實證明，賴斯并沒有辜負芬斯通的信任。1996 年，賴斯在 HCV 領域發表的第一篇文章，即報包裝盒告了包括日本研究者所稱 X 尾在內的完整 3′末端序列 。在這篇研究中，賴斯參展團隊并沒有使用負鏈 RNA，而是設計了一段 3′末端阻斷VR虛擬實境（使其 3′末端不可延伸）、5′末端磷酸化（從而可以連接其他 RNA 的 3′末端）的寡核苷酸。他們以含有 HCV（基因型為 1a）的患者血漿為原料，首先將上述寡核苷酸與病毒 RNA 的 3′末端連接，將病毒的 RNA 延長；然后利用與寡核苷酸互補的引物將延長后的 RNA 逆轉錄為 cDNA，再對其進行測序。其結果印證了日本 NCCRI 的相關發現。
雖然此研究涉及的毒株與霍頓團隊最初報告的毒株基因型相同，但與其他研究一樣，賴斯團隊也沒有在 3′末端發現霍頓團隊所說的 poly (A)片段。他們分析，這可能是因為霍頓團隊先入為主地認定這一片段存在，進而強行通過相應的寡聚脫氧胸苷（oligo dT）引物進行逆轉錄和擴增；而 RT-PCR 技術靈敏度極高，因而抓取到了極少量符合條件的 RNA，但其并不具有代表性。
賴斯團隊的研究與日本 NCCRI 的研究雖然是各自獨立進行的，但時間上還是有先后。實際上，賴斯團隊在撰包裝設計文的過程中已經注意到了日本學者的研究。他們在文章中如大型公仔實報告了這一點，并以日本的研究佐證了自己的結果。
這兩個研究的發起，直接目的都是為了辨明HCV 基因組 3′末端到底是 poly(A) 還是 poly(U)；但就其間接目的而言，二者卻又不盡相同。與日本學者似乎只關心 3′末端序列這個具體問題不同，賴斯團隊的研究從一開始就瞄準了更高的目標，亦即通過建立 HCV 的感染性分子克隆，篩選出可供病毒體外培養的細胞系，進而為包括疫苗在內的后續研究奠定基礎 。模型因此，賴斯等在文章中多次提到自己團隊尚待發表的成果，處處暗示 3′末端序列的探明只是一個階段性的成果。這預示著下一個突破已經呼之欲出了。
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